一、設備和材料

1、冰箱：0℃～4℃。

2、恒溫培養箱：36℃士1℃。

3、顯微鏡：10*——100*。

4、均質器或滅菌乳缽。

5、架盤藥物天平：0g——500g，精確至0.5g。

6、滅菌試管：10mm*100mm、16mm*160mm。

7、滅菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。

8、滅菌錐形瓶：500mL、100mL。

9、滅菌培養皿：直徑90mm。

10、注射器：0.5mL。

11、滅菌L型涂布棒。

12、滅菌刀、剪子、鑷子等。

二、培養基和試劑

1、胰酪臟大豆肉湯：按GB/T4789.28一2003中4.59規定。

2、 7.5％氯化鈉肉湯：按GB/T4789.28一2003中4.61規定。

3、血瓊脂平板：按GB/T4789.28一2003中4.6規定。

4、 Baird一Parker瓊脂平板：按GB/T4789.28一2003中4.60規定。

5、肉浸液肉湯：按GB/T4789.28一2003中4.1規定。

6、 0.85％滅菌生理鹽水。4.7兔血漿：按GB/T4789.28一2003中4.63規定。

三、操作步驟

1、增菌培養法

（1）檢樣處理：按無菌操作取檢樣25g(ml)，加入225mL滅菌生理鹽水，固體樣品研磨或置均質器中制成混懸液。

（2）增菌及分離培養：吸取5ml上述混懸液，接種于7.5%氯化鈉肉湯或胰酪陳大豆肉湯50mL培養基內，36℃士1℃培養24h，轉種血平板和Baird一Parker平板，36℃士1℃培養24h，挑取血平板上金黃色（有時為白色）菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。

（3）形態：本菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，致病性葡萄球菌菌體較小，直徑約為0.5um～1um。

（4）在肉湯中呈混濁生長，在胰酩膝大豆肉湯內有時液體澄清，菌量多時呈混濁生長，血平板上菌落呈金黃色，有時也為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。在Baird一Parker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤、直徑為2mm——3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圖。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。

（5）血漿凝固酶試驗：吸取1：4新鮮兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加人培養24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯堵養物0.5mL，振蕩搖勻，置36℃士1℃溫箱或水浴內，每半小時觀察一次，觀察6h,如呈現凝固，即將試管傾斜或倒置時，呈現凝塊者，被認為陽性結果。同時以已知陽性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對照。

2、直接計數方法6.2.1吸取上述1：10混懸液，進行10倍遞次稀釋，根據樣品污染情況，選擇不同濃度的稀釋液1mL，分別加人三塊Baird一Parker平板，每個平板接種量分別為0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用滅菌L棒涂布整個平板。如水分多不易吸收，可將平板放在36℃士1℃ lh，等水分蒸發后反轉平皿置36℃士1℃培養。

在三個平板上點數周圍有混濁帶的黑色菌落，并從中任選五個菌落，分別接種血平板，36℃士1℃ 24h培養后進行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗，步驟同增菌培養法。

3、菌落計數：將三個平板中疑似金黃色葡萄球菌黑色菌落數相加，乘以血漿凝固酶陽性數，除以5，再乘以稀釋倍數，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數。